水貂细小病毒检测技术研究

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水貂病毒性肠炎是由水貂细小病毒(MEV)引起的一种急性、剧烈和高度接触性传染病,其特征性病理变化是胃肠粘膜出现黏液,有出血性或坏死性炎症变化,主要临床症状是剧烈下痢。该病广泛存在于世界各国,是威胁水貂养殖的最大疾病之一,给养貂业带来了巨大的经济损失。近年来,国内外研究人员对水貂细小病毒的检测方法进行了多方面的研究和探索,但仍需要进一步的完善和发展。

水貂病毒性肠炎是由水貂细小病毒( Mink enteritis virus,MEV)引起的一种水貂急性、高度接触性传染病,1949年加拿大最早报道此病。1967年Johnson等在病貂脏器细胞培养物中分离到MEV。1981年,姜廷秀等首先报道了我国发生水貂细小病毒病例,此后该病逐渐扩散到全国各地。该病在自然条件下发病率较高,不同品种和年龄的貂均易感,尤其以幼貂的感染性最强,但死亡率因貂的品种和流行情况而异。1996年,吴威等通过应用抗水貂细小病毒单克隆抗体对我国分离的MEV进行系统分型，发现我国MEV流行型主要为B型。近年来，随着我国毛皮动物养殖业的不断发展，动物的健康也受到各种传染病的直接影响,也给养貂业带来了巨大的经济损失。为了保证养殖户的经济利益、明确传染病的病因、提出预防和治疗的方法,有必要深入研究现有的检测技术,进而改进现有检测技术和开发新的检测技术。

1病原学检测

1.1分离培养

病料采集:感染MEV的急性病例的血液、脾、小肠和胸腺等脏器以及粪便均可作为分离病毒的病料。

病料处理:取水貂粪便样品与生理盐水1:10比例混匀,3000rpm离心20min,取上清,经0.45um微孔滤膜过滤后备用。

病毒分离:常规方法消化胎猫肾细胞(F81),按1:10比例同步接种,37℃培养24h后,更换培养液,继续培养,逐日观察细胞病变;如无细胞病变,则继续培养4-5天后收获,并连续传代培养,至第4代仍无病变可认定为阴性。若出现细胞病变,则将培养物于-20℃,反复冻融3次后,收毒,冷冻保存备用。

病毒分离鉴定是实验室分离病毒常用的方法,但该方法耗费的时间较长,常常遇到细胞病变不出现或者出现不明显的情况。

1.2包涵体检查

取病貂十二指肠制成切片，经HE染色、镜检，观察上皮细胞的细胞内有无圆形或椭圆形、边缘整齐、界线清晰的嗜伊红包涵体。典型的核内包涵体具有诊断意义，但对于病程超过3-4天以上的病例，包涵体常常消失。闫喜军等认为水貂对水肠炎细小病毒和水貂阿留申细小病毒均易感染，且在电子显微镜下两种病毒包涵体较难区别,故仅使用该方法不能作为确诊依据。

1.3电镜与免疫电镜技术

采集典型病例带有脱落肠黏膜的粪便,经离心处理后,取上清直接制成复染色标本,进行免疫电镜观察；或者适当稀释病料，3000rpm离心20min，吸取上清液加入等量氯仿，充分振落混匀，3000rpm离心20min，吸取上清直接负染后电竞检查；也可将待检病料离心后，加入等量适当倍数稀释的标准抗MEV血清感作后,在免疫电镜下观察查有无细小病毒颗粒。

MEV病毒粒子为球形质点,直径为20-24nm，除完整质点外，还有顶部空的质点，从临床疑似水貂病毒性肠炎发病貂的粪便中分离出1株病毒,将病毒接种于F81细胞,取分离毒第6代细胞培养物，反复冻融3次，以5000rpm离心10mim取上清,用0.5%磷钨酸进行负染，电镜观察发现球形、无囊膜，直径20-24nm的细小病毒样粒子。

2免疫学检测

2.1免疫荧光检测

免疫荧光检测是一种免疫组织化学反应,以荧光物标记抗体进行抗原定位,可以准确地进行病毒抗原的细胞内定位和病毒复制过程的研究,具有快速、特异、灵敏、直观的特点。取病貂肠粘膜、淋巴结等组织制作的冷冻切片,或接种病毒的细胞培养物,用免疫荧光抗体进行着染,利用荧光显微镜观察,可以看到细胞内出现特异性荧光,从而快速诊断MEV。

1987年瑞典学者 E. Rivera等成功地应用免疫荧光抗体技术检出细胞分离物中的MEV和FPV,继而又成功地发展到用固相载体荧光抗体试验检测MEV和CPV。在我国,李增光等用F81分离和增殖病毒,并收获细胞 “飞片”，制备高免疫血清和荧光抗体,将“飞片”用荧光抗体染色,并进行镜检,同时进行阻断实验,可发现感染细胞的核内有明显的荧光,并通过阻断试验证明试验结果的特异性和可信性,这是我国首次在实验室成功地用荧光抗体技术检出并鉴定细胞分离物中的MEV。

2.2血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验

血凝和血凝抑制试验是一种理想的病毒鉴定和血清学诊断方法,具有简单、快速的特点。1984年,韩慧民等首次利用血凝和血凝抑制试验对MEV进行检测,该方法还可用来测定疫苗的效价。

MEV是细小病毒属中血凝特性较弱的病毒之一，仅在4℃、PH6.0-7.2条件下对猪和恒河猴的红细胞有凝集作用,也能凝集马和猫的红细胞。实验证明凡出现临床症状的貂血凝实验均呈阳性,部分貂没有明显临床症状,但也呈阳性,这种貂是貂群中的隐性传染源。但由于存在无血凝性的MEV-S毒株,还要应用其他方法进行检测。诊断中所用的红细胞须为新鲜红细胞,不仅保存期短,而且HA敏感性受供血个体的影响较大,故限制了这种诊断方法的推广应用。

2.3酶联免疫吸附试验( ELISA)

ELISA和HA在接种后5-6d最易检出病毒,且两者都可检出细胞培养的MEV,而与阿留申病毒、流行性卡他性胃肠炎病原无交叉反应。Voller2等建立了双抗体夹心 ELISA方法,采用方阵滴定法测定试剂最佳浓度,OD490值>0.30即判为阳性。吴英平等选用CPV作为抗原、酶联SPA作间接抗体,建立了 PPA-ELISA,与HI试验的符合率为88.4%,能检出貉、犬和水貂细小病毒抗体,是一种特异、敏感、简易的诊断方法。王建科等以抗MEV单克隆抗体为捕获抗体、兔抗MEⅴ多克隆抗体为检测抗体,建立了双抗体夹心ELISA方法。双抗体夹心 ELISA方法的建立为生产上提供了一种更简单、快速、灵敏、特异的MEV检测方法。

2.4对流免疫电泳(CIEP)

对流免疫电泳主要用于检测病貂粪便中的病毒,也可检测水貂血清中MvE特异性抗体,从而作出准确的诊断,该方法应用于貂感染后4-6d的早期诊断。吴威等在国内首次建立了对流免疫电泳诊断MEV的方法,该试验表明抗原和抗血清CIEP的工作单位分别为32和8,抗原抗体经最佳电泳时间40-60分钟后出现清晰的沉淀线,实验证明CIEP方法特异性强、检出率高,敏感性、重复性均好。该方法简便、快速、准确,可在各水貂场应用。

2.5琼脂扩散试验(AGP)

琼脂扩散实验是MEV最常用的检查方法之一,琼脂扩散实验可以用己知的MEV抗体检测病料中的MEV抗原成分,也可以用己知的MEV抗原检测发病水貂血清中的抗体效价,但与血凝和血凝抑制试验相比，此法的敏感性较低。

取病貂黏液管状粪便加约3倍体积的生理盐水，加双抗处理，经离心后的上清液作为组织抗原。阳性血清可用康复水貂血清或用家兔血清制成特异性沉淀素。37度敢作24h后出现沉淀线者作为阳性。试验证明，MEV感染过程中沉淀抗体出现比补体结合抗体和中和抗体早，一般在感染后第6d可以检测出60%，伺候滴度迅速增高，感染14d时，病貂血清中即可出现1:8-1:16的沉淀抗体。

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